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Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 9483 (2022) Citare questo articolo

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Le nanoparticelle lipidiche (LNP) per il rilascio di RNA e DNA hanno attirato notevole attenzione per la loro capacità di trattare un’ampia gamma di malattie e di vettorizzare l’mRNA per i vaccini COVID. Gli LNP sono prodotti mescolando biomolecole e lipidi, che si autoassemblano per formare la struttura desiderata. In questo ambito, la microfluidica mostra evidenti vantaggi: elevata qualità di miscelazione, condizioni di basso stress e preparazione rapida. Gli studi sugli LNP prodotti nei micromiscelatori hanno rivelato, in determinati intervalli di portate, un degrado delle prestazioni in termini di dimensioni, monodispersità ed efficienza di incapsulamento. In questo studio ci concentreremo sul micromiscelatore ad anello, che si adatta bene alla produttività elevata. Riveliamo tre regimi, affiancato, transitorio e altamente misto, che controllano le prestazioni di miscelazione del dispositivo. Inoltre, utilizzando crio-TEM e analisi biochimiche, mostriamo che le prestazioni di miscelazione sono fortemente correlate alle caratteristiche degli LNP che produciamo. Sottolineiamo l'importanza del rapporto di portata e proponiamo un criterio fisico basato sull'insorgenza di instabilità temporali per produrre LNP con caratteristiche ottimali in termini di geometria, monodispersità e resa di incapsulamento. Questi criteri sono generalmente applicabili.

Nell’ultimo decennio sono stati fatti molti progressi. Infatti, dalla comparsa dei primi micromiscelatori all'inizio del secolo, sono stati sviluppati circa un centinaio di dispositivi funzionali basati su concetti diversi. Tutti presentano vantaggi e svantaggi, ma nel complesso gli utenti spesso trovano geometrie corrispondenti alla loro applicazione di interesse nel catalogo dei miscelatori microfluidici1,2,3. Negli ultimi anni è emersa l’idea di utilizzare questi dispositivi per produrre LNP (nanoparticelle lipidiche)4,5. Gli LNP sono emersi come il gold standard per il rilascio degli acidi nucleici6. Sono nanoparticelle complesse, di 50-100 nm di diametro, composte principalmente da lipidi cationici ionizzabili che possono separarsi dagli altri componenti lipidici quando le loro cariche vengono neutralizzate, portando alla formazione di goccioline di olio amorfo nel nucleo degli LNP, come descritto in uno studio studio recente7,8. La molecola terapeutica nell'LNP dipende dall'applicazione. Può essere DNA, mRNA o siRNA. Le entità funzionali intrappolate o adsorbite nell'interfaccia includono porzioni PEG (solitamente legate a una catena lipidica), lipidi helper e colesterolo. Le nanoparticelle lipidiche offrono molti vantaggi rispetto ai precedenti sistemi di rilascio di acidi nucleici basati su lipidi: elevata efficienza di incapsulamento degli acidi nucleici, trasfezione più potente, migliore penetrazione nei tessuti e bassa citotossicità e immunogenicità. Queste caratteristiche rendono le nanoparticelle lipidiche ottimi candidati per il rilascio di acido nucleico, come dimostrato dai vaccini a base di mRNA contro il COVID.

Gli LNP si formano attraverso un processo di autoassemblaggio. Le simulazioni numeriche suggeriscono che il processo di autoassemblaggio comprende tre fasi: assemblaggio delle particelle in cluster discoidali, aggregazione dei cluster in patch di membrana più grandi e formazione di vescicole9. L’autoassemblaggio per diffusione sarebbe troppo lento (ci vorrebbero giorni), quindi è necessaria la miscelazione idrodinamica. L'uso di miscelatori standard5 in contenitori di grandi dimensioni è un'opzione. Tuttavia, questi miscelatori generano polidispersità dimensionale insieme a una bassa efficienza di incapsulamento. Pertanto, sono necessarie fasi di postelaborazione come filtrazione, estrusione e centrifugazione per migliorare la qualità degli LNP prodotti in questo modo. In questo contesto è rilevante l’uso di miscelatori microfluidici. È stato recentemente dimostrato che la microfluidica consente la produzione di LNP di qualità accettabile in termini di monodispersità e resa di incapsulamento in un unico passaggio con rese elevate. In Fujishima et al.10 e Shepherd et al.11, è stato utilizzato un micromixer a spina di pesce sfalsato12. Una limitazione dei micromiscelatori a spina di pesce è la loro bassa produttività. Questa limitazione può essere aggirata parallelizzando il sistema11. Tuttavia, questa opzione genera complessità, aumenta i costi e riduce l’affidabilità. I micromiscelatori inerziali che operano a portate significativamente più elevate e quindi a portate più elevate offrono una soluzione, ma finora, sebbene si possano trovare alcune indicazioni in letteratura, le condizioni in cui dovrebbero essere utilizzati per ottenere LNP funzionali non sono state ancora completamente chiarite.

4 ml/min: Highly mixed regime with homogeneity factors above 80% and flat, reproducible concentration profiles. The Reynolds number range lies between 220 and the maximum value reached in the experiment, i.e., 1100./p> 4 ml/min at 7% (see Fig. 8B). In parallel, the EE was approximately 60% below 2 ml/mn, while particles formed at higher Q, above 4 ml/min, had an EE of approximately 80% (see Fig. 8C). These results were consistent with the results of the mixing study we performed. We have plotted, on the same graph, the boundaries of the three zones we singled out in Fig. 7 i.e., the poorly mixed, transition and highly mixed regions. Notably, the characteristics of the LNP structure correlate well with the mixing characteristics of the device. In addition, the ζ potential, indicating the effective surface charge29, was also measured. Regardless of the flow rate used, all LNPs exhibited a zeta potential of ζ = − 13 mV + /− 4 mV at pH 7.4 and were thus slightly negative. The measurement was consistent with Ref25 and suggested a loss of the positive charge of the ionizable lipid./p> 4 mL/min. At high FRR, \(\varepsilon_{m}\) is close to that of water, and the LNPs have optimal properties, while at small FRR, \(\varepsilon_{m}\) is substantially smaller, the energy landscape ‘seen’ by the LNP constituents is changed, and we may hypothesize that this affects the self-assembling process and thereby LNP morphologies in a detrimental manner. This type of situation occurs when important quantities of ethanol are used in the formulation24,30,31,32. From Fig. 9C, we estimate that the crossover between the nonoptimal and optimal cases is located around an effective relative dielectric constant \(\varepsilon_{m}\) close to 60, still for Q = 4 ml/min, which corresponds to a flow-rate ratio (FRR) on the order of 2./p>

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